去甲肾上腺素（Norepinephrine，NE）是中枢神经和交感神经系统中关键的儿茶酚胺类神经递质之一，它能够通过快速动态的释放/结合过程介导神经元信号传递、情感调节和影响器官功能。NE水平的失衡与许多神经退行性和精神疾病密切相关，如阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)等。然而，由于生物体中NE含量与分布的动态性和瞬时性（ms-s），目前仍然缺乏有效的分子探针对其进行实时、快速、精准的动态监测和定量荧光分析。
此前，华东师范大学田阳教授团队已经成功开发了一种百毫秒级快速响应的小分子荧光探针，通过对反应过渡态和探针分子构象的双重调控实现了对NE的百毫秒级快速检测（Nat. Commun. 2023, 14, 1419）。在此基础上，团队近期对探针结构进行了进一步的设计和优化，开发了一系列新型的近红外激发有机荧光探针分子（图1），通过水分子催化效应和取代基效应的双重调控，成功地将NE的响应时间进一步缩短至60毫秒，这是目前报导的对NE响应速度最快的小分子荧光探针。此外，该探针具有高特异性、高灵敏度，以及近红外比率型响应性能，从而实现了在神经元、脑切片和活体鼠脑等不同层次、不同区域中NE的快速、精准定量荧光成像，成果在线发表在《美国化学会志》(J. Am. Chem. Soc., 2023, DOI: 10.1021/jacs.3c09239)上。
图1. 探针的分子设计、识别机理及合成路线图
针对探针表现出的超快响应特性，课题组系统分析了探针分子的亲水性、离去基团活性、取代基电子效应，以及反应位点的空间位阻效应等对识别反应动力学的影响。对反应历程的理论计算表明，水分子可以参与识别反应并形成一个六元环过渡态，促进了分子间质子转移过程，有效降低了反应能垒（图2A）。实验结果也证实了探针在纯水环境下比无水环境下反应速率提升约680倍（图2B）。研究发现，离去基团苯硫酚的对位取代基（甲氧基、叔丁基、氟和甲基）可以进一步调控反应速率，具有强吸电子特性的氟取代探针具有最快的反应动力学（图2C，D）。这是由于吸电子基团可以进一步增强反应位点羰基碳的亲电性，从而使氨基的亲核过程具有更低的反应能垒，促进反应的进行（图2E）。
图2. 探针的反应动力学和反应机理研究
基于探针对NE响应的高特异性、高灵敏度、高时间分辨率以及近红外比率型响应等优异性能，课题组进一步研究了帕金森症模型组活神经元中内源性NE 的超快动态、定量荧光成像，分别追踪了在外部电流、高钾离子和抗氧化剂药物等不同刺激、不同模型下神经元中NE浓度的实时响应情况（图3）。结合急性脑切片和活体鼠脑中NE水平的动态变化研究，揭示了NE与帕金森症病理之间的密切相关性，证实了帕金森症鼠脑中NE的含量显著低于正常组，而抗氧化药物N-乙酰半胱氨酸（NAC）的治疗，有助于NE水平的恢复（图4），这为帕金森症病理机制和药物作用机制的解析提供了实验支持。
图3. 探针用于神经元中NE的特异性、快速比率荧光成像
图4.探针用于脑切片和活体鼠脑中NE的近红外比率型荧光成像
该工作不仅开发了一种用于去甲肾上腺素活体原位分析的灵敏、快速、精准的小分子荧光探针，为生物学家研究神经递质及其生理功能提供了有效的分子工具；同时，从化学反应的机理上解释了识别反应动力学的加速机制，为新型探针开发和反应动力学研究带来新的启发。论文的第一作者为华东师范大学博士研究生韩玉界，论文的共同通讯作者为张琪伟教授和田阳教授。该研究得到了国家自然科学基金和中央高校基础研究基金的支持。
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.3c09239
Sub-100 ms Level Ultrafast Detection and Near-Infrared Ratiometric Fluorescence Imaging of Norepinephrine in Live Neurons and Brains
Yujie Han, Leiwen Mao, Qi-Wei Zhang*, Yang Tian*
J. Am. Chem. Soc. 2023, DOI: 10.1038/s41467-023-36869-3